冷冻传输扫描电镜Cryo-SEM的技术定律与操作

统是在整个反复中都，尽早保证探针的再行生和热力状稳态，以尽意味著分散反复中都的耐久性和清洁度。

汽化分散器可以方便的分散探针。在分散反复中都，探针显现单单汽化和热力状稳态

4 探针催化—再行生松脱和刨削

除非要研究工作的较厚是共存沾染的，否则有必要对探针展开松脱或挤压，以说明了内部构件，以去除不代表真实世界探针的塑料。一般来说，再行生松脱的探针比用锋利的刀片挤压流水果探针受益的较厚要安静得多。

不幸的是，在再行生松脱中都，松脱面的的梯度无法遏制，因为它优先沿着介面的，如膜脂双层的疏流水扎波罗热区。在一个复杂的子系统中都，如肝细胞，松脱矩形的常从一个膜双分子结构层预设到另一个膜双分子结构层，在肝细胞把手和肝细胞膜密切关系交叉松脱肝细胞质，诱发一个半可视化的肝细胞构件视三幅。

松脱器并不一定是一个加压的铝刀片，可以手动采用，也可以以纤米级尺度机械设备驱动，电子元件并不一定安装在再行生催化一楼中都。尽管松脱的高于度可以设定在一纤米少于，但再行生探针很脆，所以较难有趣地权衡到松脱的所在位置。可以再行初步辨别后，有意味著对探针重新松脱，以依次辨别探针的并不相同矩形的。

如果能够遏制松脱的矩形的，或者松脱面的能够一个填塞的面的，并不一定可以采用另一种电子技术；还有再行生刨削。再行生探针分散到再行生超纤切片机上，然后用天花板刀或再行生钻石刀以高于度遏制的方式将（从纤米到激光级）来刨削较厚。这样，就可以有趣的权衡到有意思的横切面的周边。填塞的较厚对于确切的形稳态辨别和能谱量化是极为重要的。

A.再行生松脱和B.再行生刨削的相比之下。在再行生松脱中都，松脱倾向于沿着阻力总和的矩形的，如沿着膜的疏流水介面的，然后越过肝细胞质，直到到达下一个膜。再行生松脱则转变成一个不会凹陷的光滑较厚。

同一探针并不相同松脱方式将的相比之下：A.再行生松脱和B.再行生刨削。在再行生松脱的情况下，探针说明了单单一些可视化面的相，而再行生刨削的探针较厚光滑。

5 探针打算-结晶

结晶有两个重要的功能。

1.在再行生和分散反复中都，由于流注满寒冷水的较厚上的结晶，探针较厚会被霜废料。结晶将其从较厚去除，从而沾染单单原始探针构件。

2.由于沾染了探针内部的构件，使可视化的超纤构件受益了更高的辨别。在越过探针的缝隙中都，偏爱是膜会被抬起来，因此说明了单单肝细胞组织。

结晶反复能够有趣遏制探针的加压，浓度区间在-90°C至-110°C之内，加压运动速度是热力个数和浓度的函数。结晶可以在探针久内展开，可以同时辨别探针，并判断该反复何时完成。权衡到塑料对样品的敏感性，要求在极低电流下辨别。

此另有，结晶所需的浓度和加压整整并不一定是根据经验权衡到的，并在抛光或催化一楼展开。当达结晶完成时（根据经验），能够将探针浓度减小以停止这一反复。如果结晶过度了，会引发探针中都的构件崩塌。

纯流水的理论相三幅，说明了了纯流注满并不相同压力和浓度下的结晶率。较差的热力和极低于的浓度才会引发结晶率的缩减。计算结果基于Umrath (1983) Mikroskopie 40, 9-37。三幅表由昆士兰大学的Roger Wepf提可让。

一旦结晶反复完成，探针并不一定能够大块一层金属和抛光或在<-130°C的浓度下蒸镀一层磷[1]。目的是是和常规SEM一样，探针须导电以便核磁共振。

附注[1]：可以尝试不镀导电膜，近代场发射电镜都可以不镀膜在极低减慢电流下核磁共振

在大多数近代的再行生催化子系统中都，这一催化反复是实际上自动化的，结晶和镀膜的工作曲线都可以留存下来可让今后采用。

A. 再行生刨削后的三叶草的根，因此不会说明了单单明显的构件。B. 结晶后，说明了肝细胞构件。C. 在打算反复中都，结晶并覆盖面的积在再行生探针上的霜。D. 结晶去除霜废料后的探针。三幅片由塔斯马尼亚国立大学的Hua Chen和维多利亚州大学的Patrick Hayes提可让。

6 探针催化-镀膜

生物学探针天然不导电，在常规加载电流下，较难在SEM中都这样一来辨别。Cryo-SEM也不例另有，探针会受到启动时物理现象、样品伤害和信噪比的影响。为了缓解这些原因，探针并不一定会镀一层大小不一的（并不一定是几激光）金属和或磷抛光，金属和或磷来自再行生催化场内置的大块镀膜机。镀膜使探针不具电导率，免受样品伤害，并提高于SE和BSE的收率，获取较佳的核磁共振恒星质量。金属和抛光一般选择诸如钻石、金或钯等。此另有，的设计场发射成像，可尝试不镀导电膜，在极低减慢电流下这样一来核磁共振。

防晒霜的Cryo-SEM核磁共振，（A）从未镀膜，说明了启动时，（B）镀膜，说明了较佳的核磁共振恒星质量。

7 Cryo-SEM加载

在Cryo-SEM中都，再行生探针能够在再行生台上辨别，并不一定在-140°C以下，以可避免探针的进一步结晶。此另有，需要采用一个罩在探针下方的防废料把手，并保证极最低探针的浓度，以不必要废料。SE和BSE探测把手都可以可用Cryo-SEM。极低减慢电流并不一定可用较厚核磁共振，但对于保持稳定的探针，也可以采用更高于一点的电流（偏爱是针对积体电路探测把手）。

在选择加载参数时，能够权衡下述：1约束探针启动时（如优化样品电流、成像运动速度、改善电导率/抛光）。2 可避免样品伤害（例如，优化反转倍数、样品电流和镀膜类型）。3 优化成像运动速度以冗余信噪比。4权衡关键点，除此以另有是对大型探针而言。5频谱的冗余（例如，较厚显然则有极低电流和SE频谱，化学物质信息则有高于电流和BSE频谱）。

8 Cryo-SEM的类型量化

在展开EDS类型量化时，对含流水的探针展开再行生大部分是金标准（更快再行生下，不会结晶或结晶非常少），因为不会有类型方向移动所在位置或人员伤亡。在生物学学中都，许多组成类型，除此以另有是轻类型，很非常容易扩散，通过其他的探针催化原理，不可可避免地会引发一些类型从探针中都方向移动或人员伤亡。

灰辣椒扇叶的苯、锌和氧类型三幅（再行生刨削）。O类型分布三幅说明了了该植物的构件。三幅片由维多利亚州大学的Caio Guilherme-Pereira提可让。

EDS既能定性量化，也可以化学合成量化，以权衡到类型的所含。再行生探针中都的类型所含是以mmol kg-1为单位的，这比以干重为单位的浓度更有生物学含意。

探针的再行生松脱对定性结果来说是够大的，但为了有效率的化学合成量化，能够一个平坦的较厚，因为面的相落差会影响X射线的样品，除此以另有是轻类型的样品。再行生刨削可以诱发一个非常平坦的较厚，适合化学合成量化，但不能很好的说明了探针的任何构件信息。

由于磷和氧在并不相同的生物学构件中都的浓度并不相同，这些类型的分布三幅对于阐明也就是说构件除此以另有感兴趣，但在结晶反复中都能够非常注意浓度和整整的遏制。

扇叶的磷和氧类型三幅（再行生刨削），说明了了SE三幅像中都不非常容易辨别到的肝细胞构件。三幅片由Peta Clode提可让，维多利亚州大学

为了不影响EDS的化学合成结果或可避免一些相异峰的抑制，再行生探针最单单色镀一层与有意思的类型不相异的塑料，常见的膜层包括磷、铝或锑。对于大部分生物学塑料，15kV的减慢电流没法激发大多数有意思的X射线（包括锰、铁、铜），并提可让左右2µm的空间分辨率。

9 Cryo-SEM的人为

在Cryo-SEM的探针打算，及全面性工作系统设计中都的任何阶段都意味著会加进人工人为。为了尽意味著的可避免人为，探针原本的再行生和留存是不可忽视的步骤。由于SEM的探针并不一定相比之下大，要意味着整个探针的天花板稳态（无冰晶）留存意味著很困难。然而，如果只辨别探针的另有较厚，这比辨别内部构件的原因要小。当再行生运动速度缓慢时，转变成的冰晶概率很高于并且会相比之下大，会影响或受到破坏探针的纤观构件。

Cryo-SEM三幅像中都的人为另一个重要相关联是废料。由于探针浓度非常极低，生稳态环境中都的废料很非常容易结晶在探针较厚。废料意味著来自探针久，比如热力子系统中都采用的猪油的磷氢化合物，或者来自探针本身，如从探针较厚结晶的流氯离子结构，或来自氧气（流水及/霜）。通过来作处理方式探针和采用抗废料器可以减少废料。

在Cryo-SEM工作中都遇到的人为。A. 菌类探针上的启动时物理现象。B. 霜冻废料。C.流水悬浮探针的再行生伤害。D. 负载皂激光外层流水悬浮上的局部样品伤害（BSE核磁共振）。三幅片由Victor Matsubara和Peta Clode提可让。

简介

1

2 Liberman, Lucy, et al. "Micrograph contrast in low-voltage SEM and cryo-SEM." Ultramicroscopy 218 (2020):

3 Issman, L., and Y. Talmon. "Cryo‐SEM specimen preparation under controlled temperature and concentration conditions." Journal of microscopy 246.1 (2012): 60-69.

4 Nijsse, Jaap, and Adriaan C. van Aelst. "Cryo‐planing for cryo‐scanning electron microscopy." Scanning 21.6 (1999): 372-378.

5 Wightman, Raymond. "An Overview of Cryo-Scanning Electron Microscopy Techniques for Plant Imaging." Plants 11.9 (2022): 1113.

取自和他的孩子们，作者孙千

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